細胞/組織裂解液試劑盒

背景簡介：

從細胞或組織中提取到完整的蛋白質樣品是影響免疫印跡分析（Western blotting，WB）得到真實可靠結果的關鍵因素之一。在實際操作中，從細胞膜、細胞質、細胞器及細胞核中提取蛋白質通常采用去污劑緩沖液（如RIPA 緩沖液）和/或物理破碎（如超聲處理）的方法；尤其，含有0.1% SDS 的RIPA 緩沖液或其替代品（如不含SDS 的NP-40 緩沖液）已作為一種標準方法被廣泛用于哺乳動物細胞和組織的裂解。事實上，RIPA 可以有效溶解和提取分子量小于90 kDa 的中、小分子的絕大部分的蛋白質，但其對于分子量大于90 kDa 的大分子蛋白質功效不大。為了更有效地提取到大分子蛋白，許多實驗室會將RIPA 緩沖液和超聲處理結合使用，通過超聲打斷DNA，從而降低裂解液的粘稠度。然而，超聲處理會破壞大分子蛋白。此外，為了保證蛋白質在提取的過程中不被細胞本身的蛋白酶降解和蛋白酶去修飾，各種蛋白酶抑制劑和特異的酶抑制劑要加到RIPA 緩沖液中。例如，為了減少蛋白質的降解，需要將蛋白酶抑制劑如PMSF 添加到RIPA 緩沖液中；同樣，為了抑制磷酸酶活性，需加入F化鈉和正釩酸鈉。即便如此，翻譯后修飾的蛋白信號還是不能得到有效的保護。

北京博蕾德生物生產的IntactProteinTM 細胞/組織裂解試劑盒解決了以上問題和缺陷。它可以快速完整的提取細胞和組織中蛋白質，并有效保護蛋白質的化學修飾，可以取代現(xiàn)有的RIPA 及其衍生的緩沖液，具有通用性好、應用廣泛、實用高效等優(yōu)點，同時，該裂解試劑盒在提取蛋白質時無需額外添加蛋白酶、磷酸酶以及其它酶抑制劑，無需超聲波處理，不僅可以完整提取分子量大于90kDa 的大分子蛋白質，而且對小于90kDa 的蛋白質分子應用同樣有效，大大簡化了實驗流程，節(jié)約時間和材料成本，從而在源頭上為下游的蛋白質分析提供了優(yōu)質完整的蛋白質樣品。

產品特性：

1）無需添加蛋白酶或其他酶抑制劑或超聲處理。

2）只需混合試劑A 和B；提取過程僅需15 分鐘。

3）接近完整地抽提大分子蛋白質；無超聲處理，避免蛋白質片段化。

4）保護蛋白質翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化和乙酰化）無損失。

5）適用于哺乳動物細胞和組織的提取。

儲存：

試劑A 存放于-20°C 冷凍條件，試劑B 存放于室溫或4°C 冷藏條件。

注：若試劑B 在4°C 下長時間保存，可能會出現(xiàn)沉淀，這不影響產品質量。當移至室溫下，沉淀會重新溶解。

應用：

變性蛋白的提取；免疫印跡分析

貼壁細胞實驗方案：

1）按500 體積組方B 加1 體積組方A（500:1）充分混勻，制備成組方A+B

的工作裂解液IntactProteinTM置于冰上備用。注意：根據(jù)步驟3 提前計算您需要的裂解液的體積。

2）棄去細胞培養(yǎng)基，用冰冷的PBS 清洗細胞2 次。

3）將培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板置于冰或冰水中，按5x10?細胞添加1 mL 裂解液（例如，將300μL 裂解液加入到含有1x10?細胞的35 mm 培養(yǎng)皿中）。將培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板在冰上再放置5 分鐘，偶爾左右旋轉以使裂解液全覆蓋細胞。

4）裂解5 分鐘后，使用干凈的塑料刮刀將細胞從培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板上刮下，并將裂解物收集到離心管中。

5）充分渦旋混勻裂解物（3×10 秒），并將裂解物置于冰或冰水中再放置10 分鐘以充分裂解。

6）在95℃加熱裂解產物5 分鐘。

7）將裂解產物放在冰或冰水中冷卻3 分鐘。

8）在4°C 以13,000 g 離心裂解產物5 分鐘，將提取的蛋白質的上清液轉移到干凈的離心管中。

9）使用分光光度計或SDS 兼容的蛋白質濃度測定試劑盒測量蛋白質濃度。

10）將裂解產物分裝并儲存在-20℃?zhèn)溆谩Ｗ⒁猓喝绻庖哂≯E分析采用還原SDS-PAGE 膠，必須向裂解物中添加終濃度為2–5%的β-巰基乙醇或50 mM DTT，外加0.1%的溴酚藍。上樣前應將樣品在95℃下加熱5 分鐘。

懸浮細胞實驗方案：

1）如貼壁細胞實驗方案步驟1 所述，在使用前立即準備組方A+B 工作裂解液。

2、將懸浮細胞以300 g 離心5 分鐘，棄去上清，然后用10 mL 冰冷的PBS 重懸細胞。再次離心，棄去。

PBS，用移液器將細胞重懸到殘留的PBS 中。

3、按5x10?細胞加入1 mL 裂解液，通過移液器充分混勻，然后置于冰或冰水中5 分鐘。

4、按照貼壁細胞實驗方案中的步驟5-10 進行操作。

組織蛋白抽提方案：

1、如貼壁細胞實驗方案步驟1 所述，在使用前立即準備組方A+B 工作裂解液。

2、在液氮中，使用研缽和杵將組織研磨成細顆粒。

3、按照1 g 組織使用3 mL 裂解液的比例，將冷凍組織粉末加入裂解液中。

4、按照制造商的說明使用勻漿器對組織進行勻漿。（注：勻漿會加熱樣品，勻漿時務必始終將管子底部放在冰上或冰水中）。

5、在冰上孵育勻漿樣品須> 15 分鐘以達到充分裂解（注：如果實驗同時有多個樣品，請將所有勻漿樣品放在冰上，直到完成最后1 個樣品）。

6、最后一個樣品勻漿15 分鐘后，在4℃下以13,000 g 離心10 分鐘。將提取的蛋白質的上清液轉移到干凈的離心管中。

7、按照貼壁細胞實驗方案中的步驟6-10 進行操作。

產品訂購：

細胞/組織裂解液試劑盒

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